Jako Mindray, czołowy producent sprzętu medycznego w Chinach oraz na globalnym rynku, od początku wybuchu pandemii COVID-19, czujemy się zobowiązani do organizacji platform, na których klinicyści z całego świata mają możliwość wymiany aktualnej wiedzy i doświadczeń na temat walki z wirusem.
29 kwietnia 2020 roku odbyło się w Polsce interdyscyplinarne webinarium dedykowane diagnostom laboratoryjnym. Podczas panelu najlepsi polscy eksperci z dziedzin: immunologii, wirusologii, biochemii i mikrobiologii podzielili się swoją najnowszą wiedzą oraz doświadczeniami zdobytymi na przestrzeni ostatnich tygodni pracy z diagnostyką wirusa SARS-Cov-2. Gościem specjalnym wydarzenia była Dr n. biol. Oksana Kowalczuk z Zakładu Klinicznej Biologii Molekularnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.
W czasie webinarium uczestnicy mieli możliwość zadawania pytań na żywo, zapraszamy do zapoznania się z relacją z tej części spotkania.
Pyt.: Jakie są doniesienia odnośnie do mutacji wirusa COVID-19. Czy ma to obraz w jakości badań genetycznych metodą RT-PCR?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Jak na razie nie stwierdzono mutacji w obrębie "diagnostycznych" regionów, które by wpływały na diagnostykę
Pyt.: Jak czyścić komorę laminarną?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Ja stosuję podchloryn sodu, nie polecam etanolu, bo zbyt szybko paruje, izopropanol lepszy. Skuteczne są detergenty połączone z jodem. Proszę nie stosować fenoli, bo nie najlepiej działają na RNA.
Pyt.: Uprzejmie proszę o informacje praktyczne dotyczące pakowania próbek. Konkretnie jakie probówki, jakie opakowania wtórne? Wymazówka w dedykowanej probówce? Do czego Państwo (Uczestnicy) wkładają?
Odp. (Dr hab. Agnieszka Jankowska-Kulawy): Przepisy ogłoszone przez Głównego Inspektora Sanitarnego nie określają rodzaju materiałów, z których powinny być wykonane opakowania do bezpośredniego pobierania materiału biologicznego czy opakowania wtórne. Konieczne jest zachowanie jałowości probówek do pobierania materiału biologicznego. Natomiast probówka do umieszczenia wymazówki powinna zawierać (dedykowane) podłoże, warunkujące zachowanie integralności próbki.
Pyt.: Pytanie do dr. hab. A. Jankowskiej-Kulawy, obecnie każdy pacjent trafiający na rutynowe badania laboratoryjne może być potencjalnie zakażony SARS CoV2. Czy są zalecenia dotyczące rutynowej diagnostyki laboratoryjnej moczu i krwi w obecnym stanie pandemii?
Odp. (Dr hab. Agnieszka Jankowska-Kulawy): Nie potrafię do końca odpowiedzieć na to pytanie. Generalnie każdy materiał może być zakaźny i tak go należy traktować. Wydaje mi się, że lokalnie, laboratoria mogą wydawać własne przepisy, aby ograniczyć szerzenie się zakażeń.
Pyt.: Czy w przypadku infekcji wirusem SARS jest sens badać przeciwciała IgA?
Odp. (Dr hab. Przemysław Tomasik, prof. UJ): Tego jeszcze nie wiadomo. Sugeruje się, że zaletą takich testów będzie wcześniejsze wykrycie choroby lub serokonwersji ze względu na szybsze/wcześniejsze narastanie miana w wymazach, być może też we krwi.
Pyt.: Zdjęcie kasetki nie daje gwarancji czy pacjent wykonał test poprawnie. 4 wykryte na ile wykonanych testów?
Odp. (Dr hab. Przemysław Tomasik, prof. UJ): Oczywiście ludzie są zdolni do różnych rzeczy, ale brak linii kontrolnej świadczy, że test został źle wykonany. Widoczna linia kontrolna i widoczne ślady krwi w miejscu nałożenia dają jaką-taką informację, że test został wykonany poprawnie.
Pyt.: Tylko nie wszystko na zdjęciu jest wyraźnie, a kreatywność pacjenta bywa ogromna i zależna od jego potrzeb i interesów. Zdjęcie nie daj również gwarancji, że to co widzimy to test tego pacjenta lub nawet kolejny test a nie ta sama płytka lub zdjęcie wcześniejszej płytki - zależy co pacjent chce osiągnąć. No i nie zapominajmy, że są różne programy do graficznej obróbki zdjęć, które dają szereg możliwości
Odp. (Dr hab. Przemysław Tomasik, prof. UJ): To nie jest oficjalnie zalecane postępowanie, ale propozycja wykorzystania szybkich testów, w sytuacji dość słabego badania osób kwarantannowanych. Pani zastrzeżenia dotyczące oszukiwania można rozszerzyć np. na pobranie wymazu – można wysłać kogoś w swoim zastępstwie. Ale jakie miałby ktoś uzyskać korzyści z wykazania, że przechorował COVID bezobjawowo lub że nie przechorował wcale?
Pyt.: Czy istnieje konieczność stosowania klimatyzacji w pomieszczeniach laboratorium (temperatura pracy analizatorów) i jak sobie poradzić, przy pracy z materiałem od pacjentów z COVID-19, gdy pracujemy na próbkach otwartych?
Odp. (Dr hab. Przemysław Tomasik, prof. UJ): Aerozol pojawia się przy wirowaniu. Może w pomieszczeniu wirówkowym trzeba wyłączyć klimatyzację.
Pyt.: Czy temperatura powietrza (pora roku) ma wpływ na Sars-Cov-2?
Odp. (Dr hab. Przemysław Tomasik, prof. UJ): Zdania są podzielone, jeśli temperatura to też wilgotność, ostatnio są doniesienia, o korzystnym wpływie słonecznego promieniowania UV na wirusa, więc latem powinno być lepiej.
Pyt.: Jak pracować w rutynowym medycznym laboratorium diagnostycznym z materiałem pobranym od pacjenta (mocz, krew), który jest podejrzany o zakażenie koronawirusem? Na przykład oglądanie rozmazów krwi, osadów moczów, oznaczanie grup krwi, itp.?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Bogdan Mazur): Tak jak do tej pory traktując każdy materiał pobrany od pacjenta jako potencjalnie zakaźny i postępować z nim zabezpieczonym w jednorazowe rękawiczki, fartuch ewentualnie okulary ochronne
Pyt.: Czy w przypadku oceny plwociny stosuje się zasady opisane w prezentacji czy też takie jak opisane w zaleceniach NPOA (w zaleceniach opisane jest, że ilość komórek nabłonowych, jak i liczbę leukocytów oceniamy w powiększeniu 100x)?
Odp.: (Dr hab. Agnieszka Jankowska-Kulawy): Powiększenie jest 100x.
Pyt.: Skoro w podejrzeniach COVID-19 wśród badań zalecana jest m.in. morfologia z rozmazem, jaka może być zakaźność przy otwieraniu probówki celem wykonania rozmazu?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Bogdan Mazur): Każdą próbkę materiału od pacjenta należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Jeżeli chodzi o rozmaz krwi u pacjentów podejrzanych lub chorujących na COVID wystarczy w zupełności rozmaz z analizatora hematologicznego różnicującego leukocyty na 5 populacji (5 diff), taki sam rozmaz wystarczy również do obliczania wskaźników leukocytarnych np. wspomniany w wykładzie.
Pyt.: Czy według Państwa, w obliczu tego co się aktualnie dzieje, jest szansa na zwiększenie możliwości pracy na rynku dla mikrobiologów w diagnostyce laboratoryjnej? Mam na myśli osoby, które ukończyły jedynie mikrobiologię, a nie analitykę medyczną.
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Bogdan Mazur): Nie sądzę, w laboratoriach diagnostycznych brakuje diagnostów laboratoryjnych, a kto może zostać diagnostą wynika z ustawy.
Pyt.: Jakie są doniesienia odnośnie do mutacji wirusa COVID-19. Czy ma to obraz w jakości badań genetycznych metodą RT-PCR?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Jak na razie nie stwierdzono mutacji w obrębie "diagnostycznych" regionów, które by wpływały na swoistość metody.
Pyt.: Pytanie chciałem skierować do Pana Prof. dr. hab. Tomasza Wąsika. Panie Profesorze z racji tego, że mamy wiele klastrów wirusa SARS-CoV-2 kiedy możemy spodziewać się ustąpienia pandemii? Czy jedyną szansą jest szczepionka? Czy możemy spodziewać większej liczby zakażonych na jesień?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Trzy klastry to nie tak dużo, ponadto różnice nie są duże. Jak każdy koronawirus SARS-CoV-2 będzie się zmieniał. Artykuł z Sciece sprzed 2 tygodni szacuje czas pandemii na 4 lata. Ja sądzę, że jeżeli nie będzie szybko skutecznej szczepionki (tu jestem sceptyczny, obym się mylił) to mamy przed sobą 3 lata pandemii z wygaszającą się sinusoidą zakażeń.
Pyt.: Jaka powinna być idealna próbka do oznaczeń PCR?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): Praktycznie każdy materiał się nadaje, ale należy dostosować metodę izolacji DNA lub RNA do materiału.
Pyt.: Mając na uwadze braki materiałowe oraz stabilność wirusa, proszę o informację dot. możliwości pobierania materiału na suchą wymazówkę transportowaną w temp. 2-8 st. C w terminie do 24h od momentu pobrania.
Odp. (Dr hab. Agnieszka Jankowska-Kulawy): Nie ma danych, które mówią jak długo wirus przeżyje bez podłoża transportowego, nawet jeżeli jest to temp. 2-8 st. C.
Pyt.: Kiedy mamy pewność, że prawidłowo pobrano wymaz?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): Niestety na proces pobierania materiału nie mamy wpływu, a na podstawie oceny wizualnej próbki trudno cokolwiek wywnioskować
Pyt.: Czy wiadomo coś na temat zakaźności materiału biologicznego takiego jak mocz, kał czy też krew pełna/surowica/osocze?
Odp. (Dr hab. Agnieszka Jankowska-Kulawy): W każdym z tych materiałów mogą znaleźć się cząstki wirusa więc każdy, podkreślam - każdy materiał należy traktować jako potencjalnie zakaźny. W przypadku kału dowiedziono już, że wirus może przenosić się drogą analno-fekalną.
Pyt.: Czy możliwy jest fałszywy wynik PCR u pacjentów leczonych Metotreksatem i pacjentów onkologicznych?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): Zwykle wykorzystujemy materiał bardzo specyficzny - wymazy z górnych dróg oddechowych, nie krew lub mocz które mogą zawierać stosowane leki lub produkty ich przemiany, czyli potencjalne inhibitory reakcji. Ale nie spotkałam badań na ten temat.
Pyt.: Czy można opierać się na badaniach prowadzonych na innych wirusach? np.: J. Clin Microbiol. 2012 Mar. 50 (3): 1064-5: Evaluation of swabs, transport media, and specimen transport conditions for optimal detection of viruses by PCR?
Odp. (Dr n. med. Tomasz Anyszek): Zapewne tak, jeżeli badano wirusy RNA.
Pyt.: Czy wynik ujemny wykonany z materiału jakim jest wymaz, pobrany u pacjenta w ciągu 2-3dni od kontaktu z osobą, u której potwierdzono COVID-19 wyklucza zakażenie czy należałoby go za jakiś czas powtórzyć?
Odp. (Dr n. med. Tomasz Anyszek): Optymalnie należy pobrać materiał 6-7 dni po ekspozycji, 2-3 dni to zbyt krótki okres.
Pyt.: Pytanie do Dr n. biol. Oksana Kowalczuk: Czy była prowadzona analiza wydajność izolacji RNA automatycznej i manualnej? Dotychczasowe doniesienia wskazują jednak na przewagę metody manualnej.
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): W przypadku badań w kierunku SARS-CoV-2 takich badań nie wykonywaliśmy, ale były wykonane kilka lat temu dla Izolacji DNA. Wydajność izolacji była w ok. 5 razy mniej wydajna niż izolacji manualnej kolumienkowej. Istotą rzeczy są różnice w izolacji za pomocą kulek magnetycznych, a adsorpcją na złożu w kolumnach, a nie wykorzystanie bądź nie – aparatu. Dla izolacji kolumienkowej też są automaty. Stosowane są te same zestawy, co do izolacji manualnej.
Pyt.: Czy będziemy czekać, aż wszyscy przechorują lub będą mieli kontakt z wirusem, aby nabyć naturalną odporność w postaci przeciwciał? Jak możemy skutecznie się chronić? Czy wszyscy w końcu zachorują prędzej czy później? Jeśli chodzi o ochronę, ludzie używają maseczek z gęsto tkanej bawełny czy fizeliny, natomiast mówi się, że nawet maseczki z filtrem FPP3 są nieskuteczne.
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Bogdan Mazur): Do tej pory nie ma złotego standardu postępowania z wirusem. Jeżeli chodzi o odporność populacyjną taki schemat postępowania przyjęli Szwedzi czyli wcześniej czy później zachoruje 80-90% społeczeństwa. Niestety również nie wiemy czy osoby które przechorowały wirusa uzyskały odporność na wiele lat – z pandemia mamy do czynienia niecałe pół roku.
Pyt.: W czasie wykładu padło zdanie o wirowaniu tylko w komorze laminarnej. A co z laboratoriami (przychodnia), które nie mają takich komór, a wykonują badania w moczu i we krwi?
Odp. (Dr n. med. Tomasz Anyszek): Zalecenia dotyczą próbek od pacjentów z potwierdzonym rozpoznaniem COVID-19. Bez komory laminarnej należy zachować szczególną ostrożność i unikać działań mogących wytworzyć aerozol (np. wstrząsanie, wirowanie). Na szczęście sporo czynności nie wymaga otwierania probówek i ryzyko jest wtedy iluzoryczne.
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Chodziło o wirowanie materiału zakaźnego i proces izolacji wirusa w diagnostyce w kierunku SARS-CoV-2. W każdym laboratorium wirówki powinny być wyposażone w filtry HEPA. Aerozole są niebezpieczne!
Pyt.: Laboratoria wykrywające wirusa pracują z reguły w systemie zmianowym. W jaki sposób odkażać laboratoria?
Odp. (Dr n. med. Tomasz Anyszek): Nie ma potrzeby odkażania laboratoriów.
Pyt.: Poważnym problemem jest błąd przed analityczny związany z błędnym pobraniem wymazu. Dostępne na rynku testy zawierające kontrolę ekstrakcji pozwalają jedynie na ocenę prawidłowości przebiegu procesu izolacji kwasów nukleinowych, która jednak nie daje nam pewności uzyskania wystarczającej ilości RNA wirusa/pacjenta. Jakie rozwiązania w tym zakresie są rekomendowane? Fluorymetryczna ocena ilości RNA?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): Izolujemy wszystkie cząsteczki RNA które znajdują się w badanej próbce, nie tylko RNA wirusowe. Dlatego żadna z metod oceny stężenia RNA w izolacie (w tym fluorimetryczna) nie pozwoli ocenić ilość RNA wirusowego. Odpowiedź otrzymujemy tylko drogą wykonania testu. Natomiast dodanie kontroli wewnętrznej do próbki przed izolacją pozwala na kontrolę procesu izolacji RNA (w tym RNA wirusowego).
Pyt.: Jaki jest maksymalny czas wirowania próbki?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk):
W procesach izolacji manualnej RNA wirowania są bardzo krótkie - od 30 sekund do 2-3 minut.
Pyt.: Jeśli otrzymujemy wynik ujemny, który mógł być wynikiem pobrania zbyt małej ilości materiału, jaka jest potrzebna do zbadania w jakiejkolwiek metodzie, czy jednak możemy zakładać, że jakaś ilość cząstek wirusa może być w próbówce transportującej, z której pobrano ilość materiału do badania?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): Na pewno cząstki wirusowe będą obecne, a stosowane testy molekularne mają bardzo wysoką czułość. Uważa, że zbyt mała ilość materiału nie jest częstą przyczyną fałszywie ujemnych wyników.
Pyt.: Czy w przypadku infekcji wirusem SARS jest sens badać przeciwciała IgA?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Niektóre doniesienia sugerują oznaczanie IgA. Sądzę, że obecnie powinniśmy się skupiać na panelu IgM i IgG.
Pyt.: A co w wypadku, gdy test serologiczny wykaże podwyższony poziom przeciwciał IgM? Czy jest to wskazanie do badania metodą molekularną?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Oczywiście.
Pyt.: W Polsce są dostępne tylko testy jakościowe bądź półilościowe. Nie znalazłam na razie testów ilościowych na rynku. Bardziej będą przydatne przeciwciała IgA czy IgM? Przeraża mnie komercja badań serologicznych na tym etapie, gdzie pacjent nie ma pojęcia o okienku serologicznym, ani o czułości, swoistości testu, a przede wszystkim nie ma pojęcia, co on właściwie może oznaczać. Dlaczego zatem wydano zgodę na wykonywanie tych badan bez nadzoru lekarskiego?
Odp. (Dr n. med. Tomasz Anyszek): 1/3 badań w Polsce to badania kupowane bezpośrednio przez pacjentów - tego zabronić nie można. Na szczęście zazwyczaj pacjenci konsultują wyniki z lekarzem.
Pyt.: Co to jest SA (amyloid A w surowicy)?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Białko ostrej fazy związane z HDL.
Pyt.: Czy istnieją doniesienia o objawach wyłącznie ze strony układu pokarmowego? Bez objawów z układu oddechowego?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Nie znam takich doniesień.
Pyt.: Czy używanie lampy UV na materiał pobrany od pacjenta przed wykonaniem posiewów jest zasadne? Jeśli tak jak, jak długo używać lampy?
Odp. (Prof. dr hab. n. med. Tomasz J. Wąsik): Nie, UV nie działa selektywnie i niszczy zarówno kwasy nukleinowe bakterii i wirusów, więc jeżeli mamy zrobić posiew nie możemy napromieniować materiału UV.
Pyt.: Czy wykonanie RT-PCR SARS-Cov-2, gdzie wykrywam tylko gen S wymaga potwierdzenia, myślę o wyniku dodatnim?
Odp. (Dr n. biol. Oksana Kowalczuk): Teoretycznie wykrywanie pojedynczej, ale b. swoistej dla wirusa sekwencji powinno być wystarczającym. W większości testów molekularnych stosowanych w diagnostyce zakażeń drobnoustrojami, właśnie takie testy są wykorzystywane. W odniesieniu do SARS-CoV-2 wiedza jest jeszcze dość mała, a wirus stałe się zmienia (mutuje), dlatego powielenie więcej niż 1 obszaru zapewnia zabezpieczenie przed fałszywie negatywnymi wynikami. Aczkolwiek z własnego doświadczenia - test z 1 badanym obszarem był bardzo wiarygodnym (zgodne wyniki z bardziej rozbudowanymi testami).
*
Webinarium zostało zainicjowane i zorganizowane przez Mindray w celu wsparcia pracowników opieki zdrowotnej w zwalczaniu COVID-19. Wszyscy eksperci wzięli udział w dyskusji dobrowolnie, bez konfliktu interesów.
